Το Παλάτι του Μεγάλου Μαγίστρου αποτελεί το σημαντικότερο ίσως μνημείο της Ιπποτοκρατίας [1309-1522 μΧ.]. Είναι κτισμένο στο βορειοδυτικό ψηλότερο σημείο της Μεσαιωνικής Πόλης, ως βασικό τμήμα της μεσαιωνικής οχύρωσης, δεσπόζοντας με τον όγκο του πάνω από αυτή και τα λιμάνια της. Πιστεύεται ότι κατέλαβε το χώρο, όπου βρισκόταν προηγουμένως η βυζαντινή ακρόπολη και άρχισε να κτίζεται αμέσως μετά την εγκατάσταση των Ιπποτών στη Ρόδο, δηλαδή στις αρχές του 14ου αι. Κατά τη διάρκεια της ιταλικής αναστήλωσης, κατά τη δεκαετία του 1930, το κτήριο έλαβε τη σημερινή του διαρρύθμιση, αποτελώντας το διοικητήριο, αλλά και την κατοικία του Ιταλού διοικητή. Στις αίθουσες του ορόφου ο επισκέπτης μπορεί να θαυμάσει τα ψηφιδωτά δάπεδα που μεταφέρθηκαν από τους Ιταλούς, κυρίως από κοσμικά και εκκλησιαστικά κτήρια της Κω, με σκοπό να διακοσμήσουν το Παλάτι. Εκτός από τα εντυπωσιακά ψηφιδωτά, υπάρχουν επίσης κίονες και κιονόκρανα, έπιπλα μεσαιωνικά, καθρέπτες, πίνακες, κηροστάτες και άλλα αντικείμενα που συμπληρώνουν τον διάκοσμο του επιβλητικού οικοδομήματος.
Σε τμήμα του ισογείου του Παλατιού, σε διαδοχικές αίθουσες, στεγάζεται μόνιμη έκθεση με τίτλο "Η Ρόδος από την παλαιοχριστιανική εποχή μέχρι την κατάληψή της από τους Τούρκους [1522]". Σε αυτήν περιλαμβάνονται διάφορα ευρήματα των ανασκαφών που διεξήχθησαν στη Μεσαιωνική Πόλη [κεραμεικά, γλυπτά, αποτοιχισμένες τοιχογραφίες, φορητές εικόνες, έργα μικροτεχνίας κτλ.]
Μία ακόμη μόνιμη έκθεση που καταλαμβάνει μέρος του ισογείου και του υπογείου με τίτλο "Ρόδος, 2.400 χρόνια", παρουσιάζει την αρχαία πόλη της Ρόδου μέσα από τα αρχαιολογικά ευρήματα και την έρευνα πενήντα και πλέον χρόνων.
Οι δύο μόνιμες εκθέσεις στον ισόγειο χώρο του Παλατιού είναι επισκέψιμες κατά τη θερινή περίοδο.